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生物反应器是国产高端生物药研发的基石
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生物反应器是指利用为细胞或细菌等微生物进行生化反应提供良好反应环境的设备。生物反应器中的微生物处在一个稳定的培养环境中,并能得到培养介质的循环供给。生物反应器的设计与开发除需符合GAMP5与ASME BPE等标准的相关规定外,还需了解所选用的pH、温度、氧需求、生长率等微生物培养条件,以及最终产品的表达和浓度。
生物反应器装备装有很多在位传感器和一个界面友好、变量操控灵活的数字控制系统,允许控制许多可变量参数,包括温度、搅拌转速、pH、溶解氧的浓度等。理想的高性能生物反应器应具有非常低的全混时间以及非常高的气液传递等特征,除了监控参数外,高性能生物反应器还配置了在线分析仪对重要的培养变量进行频繁监控。图1是一个典型的生物反应器系统示意图,该设备的重要培养变量能够高频率计量(30~1000 h-1),其它培养参数则可以较低频率自动取样测量(1~3 h-1)。

生物反应器可以实现质量稳定的连续培养,并对进料流量进行测量,它能够以不同的稀释倍率(精度在0.005 h-1)工作,通过培养基补料的适当设计可实现利用单一的组件完成诸如葡萄糖或氨等进液的操作。生物反应器具有气体混合后的通气功能,通过混合进气比例的变化对过程产生影响,例如,生长中的氧浓度以及产品动力学可提供在同一特定生长率的研究。利用计算机对培养参数的控制,可以对工艺进行高重复性的实验,对细胞反应基质是一个极为重要的了解手段。  
生物反应器的生物安全等级(BL)由最终用户依照相关标准制定,各房间的操作要求(例如取样废气排放,凝聚物和培养基废弃处理)都要保证操作者和环境的安全。根据病原对微生物活细胞的危险,生物安全等级(BL)分成3个安全等级空间,包括BL1-LS、BL2-LS和BL3-LS,病原危险越高、在设计和设备运行时要求房间的安全等级就越高。对于等级BL2和BL3的产品,添加辅料、取样和收获需使用密闭操作系统,污染凝聚物需收集到指定的灭活罐进行后续处理,培养结束后,生物反应器的罐体和管道需得到及时的清洗与灭菌处理。为避免取样操作带来杂菌污染,侧壁取样阀需采用封闭的取样装置(图2)。       
制造生物反应器的罐体材料分为高分子、玻璃或不锈钢,高分子材质的生物反应器为一次性产品,玻璃材质罐体可以经高压灭菌,而不锈钢罐体通过蒸汽在线消毒。

生物反应器一般为圆柱体,安装有搅拌器、夹套和绝缘层,大小从几升到几千升不等,罐体夹套用于维持最佳培养温度。由于通气、搅拌及泡沫的影响,罐体中液位以上的顶部空间常为工作体积的 20~30%;为满足在线灭菌的要求,生物反应器设计压力为-1~3bar,工作温度为143℃;设备内表面抛光度为电抛光Ra<0.4μm,以保证产品接触表面易于清洗;罐体的开孔数量、位置与类型取决于培养过程的原辅料添加(酸碱度、温度控制媒介、消泡剂和培养基等)和总预期的仪表控制(压力、液位、温度、pH和O2探头等),图4是生物反应器罐体的通用设计要求。 
高径比是罐体工作高度与内径的比例,大的高径比意味着更优的氧和热传递。耗氧发酵每分钟需要消耗大约液体体积1~1.5倍体积的气体,因此,要求罐体宽高比大于1.5,而且为了达到高的氧传递,搅拌系统一般选用多个叶轮,较低位置的叶轮用于产生径向流并保证足够的剪切分散空气气泡;上部的叶轮能产生轴向流并进行大工作量的搅拌。通常,底部与上部叶轮之间的距离为罐体直径的2/3。为产生适合大量搅拌的轴向流,以及由于细胞敏感性限制的低剪切力,细胞生物反应器的罐体高径比要求为1:1,搅拌系统需选用单一的叶轮。 
摄氧速率(OUR)是指维持细胞生长及单位细胞量必需的氧气量,OUR可以通过实验获得。首先测量饱和发酵培养基中溶解氧,然后测量微生物耗完氧气的速率;氧传递速率(OTR)是指氧气由气相传递至液相的速率。通常情况下,生物反应器的设计要求能提供足够的氧,而没必要在必需时给生物体(尤其是在指数生长期)提供最大的氧气量。由于OTR受搅拌程度和通气量的影响,因此,在生物反应器放大时需要考虑如下几个因素: 
通气量:如果空气中氧含量低于21%,可以输入纯氧作为气源; 
搅拌功率:加大输入功率可以保证更多的氧由气相传递至液相; 
压头:压头增加可以增加OTR,同时还能避免泡沫的产生; 
分布器的类型和位置:安装于最低叶轮下面的分布器可向生物反应器中输入空气或无菌气体,其最佳的安装位置为叶轮直径的3/4,如果分布器的位置距离叶轮太远,空气气泡就会在散开之前重新聚合。 
模块化设计能提前绘制焊点图,具有按图组装、质量稳定、即插即用、能满足工厂测试FAT、节省占地面积、美观大方、形式多样且便于操作等优点。生物反应器需按照3D设计图纸进行组装(图5),每套设备均可按照客户实际需求进行量身定制。
生物发酵的在线检测技术及控制是非常重要的过程,菌体制备、初级或次级代谢产物以及转化技术都是在人为给予最佳环境的培养条件下实现的。对微生物生长的外部物理条件、化学条件以及物料中生物学条件的调控是一个复杂的过程工程,目的是利于产物的生成。 
发酵参数检测反馈的大量信息有助于更好地理解培养过程,并对工艺进行优化和改进。生物发酵工程需要测量控制的物理参数包括搅拌转速、罐压、物料温度、通气量、发酵液总质量、粘度、进液流量与累积量等;生物发酵工程需要测量控制的化学参数包括pH、pO2、CO2粘度、Kla氧呼吸速率、碳源、氮源、菌体浓度、尾气排放氧/二氧化碳分压、呼吸商以及酶的比活力、物料消耗速率与产物生成速率等。 
发酵液pH的精确控制对细胞生长及产物的形成非常重要,发酵过程中,细胞或基质的消耗会导致培养液发生pH变化。生物反应器使用可耐受高温灭菌的pH传感器,多为组合式探头,由玻璃电极和参比电极组成(带有内部电解液与参比电解液),在线测量通过电极侧面多孔塞上的液体结合点与培养液接触。pH电极的测量范围为0~14,精度±0.01~0.05。pH传感器的电极内容物会随高温灭菌以及使用时间不断变化,每批次发酵灭菌前后均需用标准缓冲液给予校准。
培养液的溶解氧浓度(DO)直接影响细胞的生长,溶氧浓度过低会限制细胞供养速率,导致生长速率降低与代谢流向的改变。发酵中随着细胞的生长,菌体浓度增大,使得呼吸和耗氧速率加快,这一过程需要加大搅拌速率、通气量预计OTR氧传导速率。以基因重组大肠杆菌的流加培养为例,在一定速率的葡萄糖流加条件下,通过系统控制不断给予正/负脉冲信号对流加速度进行连续的修正。可通过观察溶氧浓度的瞬时脉冲响应,将葡萄糖浓度大致控制在临界值范围之内,使细胞生长速度处于最佳状态,并对其代谢副产物给与抑制。发酵中常用的极谱电极为电化学测量方式,即使用只有O2可渗透的膜将发酵液与电化学电池分隔,DO传感器主要结构包括膜、电解液膜、阴极、绝缘体、阳极和电解液等。 现代发酵工业的生化反应过程控制完全依赖于计算机控制系统的应用,通过可靠的数据采集系统对生产过程进行实时操控和优化,保障整个生产过程不出现偏差。计算机的过程信息数据储存功能可以方便进行工艺数据比较分析,可在线校正传感器信息与识别传感器性能的变化。目前,生物发酵工业化生产过程计算机控制是集散型控制系统(DCS),DCS集中了连续控制、批量控制、顺序逻辑控制与数据采集功能的计算机综合控制管理系统。   
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